A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) é uma técnica inovadora que possibilita a amplificação e quantificação precisa de material genético em tempo real. Essa ferramenta poderosa tem um impacto significativo em diversas áreas da biotecnologia, desde pesquisa básica até aplicações clínicas e industriais.
Fundamentos da qPCR
A qPCR se baseia na amplificação específica de DNA por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando sondas fluorescentes para monitorar o processo em tempo real. A cada ciclo de PCR, a quantidade de DNA aumenta exponencialmente, permitindo a quantificação precisa do material genético presente na amostra.
A técnica de PCR
A PCR é um processo cíclico composto por três etapas:
Sondas fluorescentes
Na qPCR, sondas fluorescentes são utilizadas para monitorar a amplificação de DNA em tempo real. As sondas se ligam ao DNA amplificado, emitindo um sinal fluorescente que é detectado pelo equipamento.
Tipos de sondas fluorescentes
Metodologias de quantificação
Aplicações da qPCR
A qPCR possui uma ampla gama de aplicações na biotecnologia, incluindo:
Por fim, a qPCR é uma ferramenta poderosa que contribui significativamente para o avanço da biotecnologia. A escolha da metodologia ideal depende da aplicação específica e dos objetivos do estudo. As diversas variações da técnica permitem a quantificação precisa de material genético em diversas áreas, desde pesquisa básica até aplicações clínicas e industriais.
Referências Bibliográficas para complementar sua leitura:
1. Livak, K. J., & Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods, 25(4), 402-408.
2. Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., … & Wittwer, C. T. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical chemistry, 55(4), 611-622.
3. Nolan, T., Hands, R. E., & Bustin, S. A. (2011). Quantification of mRNA using real-time PCR. Nature protocols, 6(2), 190-205.
4. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., & Wittwer, C. T. (1997). Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical biochemistry, 245(2), 154-160.
5. Vogelstein, B., & Kinzler, K. W. (1999). Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences, 96(16), 9236-9241.
6. Espy, M. J., Uhl, J. R., & Sloan, L. M. (2006). Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clinical microbiology reviews, 19(1), 165-256.
7. Schmittgen, T. D., & Livak, K. J. (2008). Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature protocols, 3(6), 1101-1108.
8. Butler, J. M. (2001). Forensic DNA typing: biology, technology, and genetics of STR markers. Elsevier.
9. Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers, C., Kalsheker, N., … & Markham, A. F. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic acids research, 17(7), 2503-2516.
10. Malorny, B., Hoorfar, J., Bunge, C., & Helmuth, R. (2003). Application of real-time PCR for detection of foodborne pathogens. Current opinion in biotechnology, 14(3), 297-304.
11. Kwok, S. (2001). Quantitative PCR for clinical diagnostics. Current opinion in molecular therapeutics, 3(3), 241-248.
Fundamentos da qPCR
A qPCR se baseia na amplificação específica de DNA por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando sondas fluorescentes para monitorar o processo em tempo real. A cada ciclo de PCR, a quantidade de DNA aumenta exponencialmente, permitindo a quantificação precisa do material genético presente na amostra.
A técnica de PCR
A PCR é um processo cíclico composto por três etapas:
- • Desnaturação: a temperatura da amostra é elevada para separar as fitas de DNA.
- • Anelamento: a temperatura é reduzida para que os primers, oligonucleotídeos específicos para a sequência de DNA desejada, se liguem às fitas molde.
- • Extensão: a temperatura é elevada novamente para que a DNA polimerase, uma enzima, sintetize novas fitas de DNA a partir dos primers.
Sondas fluorescentes
Na qPCR, sondas fluorescentes são utilizadas para monitorar a amplificação de DNA em tempo real. As sondas se ligam ao DNA amplificado, emitindo um sinal fluorescente que é detectado pelo equipamento.
Tipos de sondas fluorescentes
- • Sondas TaqMan: sondas oligonucleotídicas específicas que se ligam ao DNA amplificado, liberando um fluoróforo durante a extensão da fita. [1]
- • Sondas SYBR Green: corantes fluorescentes que se ligam a qualquer DNA de fita dupla, permitindo a quantificação não específica. [2]
- • qPCR intercalante: utiliza corantes intercalantes que se ligam ao DNA de fita dupla, aumentando a fluorescência durante a amplificação. [3]
Metodologias de quantificação
- • Método absoluto: utiliza uma curva padrão de concentração de DNA conhecida para determinar a quantidade de DNA na amostra.
- • Método relativo: compara a quantidade de DNA na amostra com a quantidade de DNA em um controle.
Aplicações da qPCR
A qPCR possui uma ampla gama de aplicações na biotecnologia, incluindo:
- • Diagnóstico de doenças: detecção de patógenos, como vírus, bactérias e parasitas. [6]
- • Quantificação de expressão gênica: análise da atividade de genes em diferentes condições. [7]
- • Genética forense: identificação de indivíduos a partir de material genético. [8]
- • Análise de mutações: detecção de alterações na sequência de DNA. [9]
- • Controle de qualidade de alimentos: detecção de patógenos e contaminantes em alimentos. [10]
- • Desenvolvimento de biofármacos: monitoramento da produção de proteínas recombinantes. [11]
Por fim, a qPCR é uma ferramenta poderosa que contribui significativamente para o avanço da biotecnologia. A escolha da metodologia ideal depende da aplicação específica e dos objetivos do estudo. As diversas variações da técnica permitem a quantificação precisa de material genético em diversas áreas, desde pesquisa básica até aplicações clínicas e industriais.
Referências Bibliográficas para complementar sua leitura:
1. Livak, K. J., & Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods, 25(4), 402-408.
2. Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., … & Wittwer, C. T. (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical chemistry, 55(4), 611-622.
3. Nolan, T., Hands, R. E., & Bustin, S. A. (2011). Quantification of mRNA using real-time PCR. Nature protocols, 6(2), 190-205.
4. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., & Wittwer, C. T. (1997). Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical biochemistry, 245(2), 154-160.
5. Vogelstein, B., & Kinzler, K. W. (1999). Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences, 96(16), 9236-9241.
6. Espy, M. J., Uhl, J. R., & Sloan, L. M. (2006). Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clinical microbiology reviews, 19(1), 165-256.
7. Schmittgen, T. D., & Livak, K. J. (2008). Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature protocols, 3(6), 1101-1108.
8. Butler, J. M. (2001). Forensic DNA typing: biology, technology, and genetics of STR markers. Elsevier.
9. Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers, C., Kalsheker, N., … & Markham, A. F. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic acids research, 17(7), 2503-2516.
10. Malorny, B., Hoorfar, J., Bunge, C., & Helmuth, R. (2003). Application of real-time PCR for detection of foodborne pathogens. Current opinion in biotechnology, 14(3), 297-304.
11. Kwok, S. (2001). Quantitative PCR for clinical diagnostics. Current opinion in molecular therapeutics, 3(3), 241-248.
